Використання морфофункціональних змін клітин риб як біоіндикаторів хімічного забруднення водойм

Проблема забруднення водного середовища набуває все більшої гостроти у більшості країн світу включно з Україною. Зміни екологічних чинників, викликані зростаючим антропогенним впливом, призводять до загрозливої ситуації щодо виживання живих організмів і здоров'я людини.

Тому в комплексі заходів, спрямованих на запобігання негативним впливам на здоров’я, пов’язаних із чинниками водного середовища, важливе місце повинна займати оцінка якості води, зокрема її безпечність для людини [1]. У зв’язку з цим розробка ефективних методів оцінки як прямого, так і опосередкованого впливу техногенних та інших забруднювачів на живі організми стає все більш актуальною. Антропогенні зміни водних екосистем не можуть не відображатись на фізіологічному стані гідробіонтів, зокрема риб. Костисті риби - досить численний і розповсюджений клас, що займає важливе місце в екосистемі, визнані зручними тест об'єктом для вивчення якісного стану водного середовища.

Матеріали і методи. Досліджувані зразки води:. Для дослідження впливу антропогенного забруднення, зразки води були відібрані з прісноводних водойм України: з ріки Дніпро (р-н Гідропарк та р-н Бортничі) та з ріки Десна (р-н Хотянівка), загалом три станції. У всіх зразках води визначали електропровідність, рН та проводили хімічний аналіз на присутність органічного вуглецю та деяких неорганічних речовин. Співставлення одержаних показників з нормативами, розробленими для оцінки якості води, показало, що відібрані проби річкової води характеризувались відсутністю значних відхилень від нормативних показників, за виключенням перманганатної окислюваності та загального органічного вуглецю, вміст якого був підвищеним. Це виключає можливість впливу на функціональний стан риб під час експерименту зміни загальних гідрохімічних показників досліджуваних зразків води.

Тест-об’єкти. У дослідженнях використовували акваріумних риб – Carassius auratus, вирощених в акваріумах лабораторії.

Приготування цитологічних препаратів. В дослідженнях використовували клітини крові, зябер та хвостового плавця. Кров відбирали з хвостової вени й готували цитологічні препарати за стандартною методикою [2].Тканину зябер (зяберні пелюстки) та регенеровану тканину хвостового плавця, тобто ту, що утворилась під час перебування риб в досліджуваному розчині фіксували в оцтово-гліцериновій суміші. Цитологічні препарати готували з гомогенізату тканини. Фарбування поводили за методом Романовського-Гімза стандартним розчином Азур-еозину. Цитологічні препарати аналізували під світловим мікроскопом із загальним збільшенням х1000. На заключному етапі досліджень проводили аналіз та статистичну обробку результатів за допомогою стандартного пакету програм Excel. Статистичну достовірність співвідношення різних типів клітин крові оцінювали за параметричним t-критерієм Ст’юдента, зміну частоти появи аномалій ядра – за непараметричним φ – критерієм Фішера [3, 4].

Результати дослідження. Було проведено дослідження впливу, відібраних зразків води на гематологічні показники та показники цитогенетичної стабільності еритроцитів та епітеліальних клітин зябер і хвостового плавця риб Carassiusauratus. При впливі досліджуваних проб спостерігали тенденцію до зниження відсотку лімфоцитів(табл. 1), однак ці зміни не були статистично значимі. Всі досліджувані проби води спричиняли достовірне зростання відсотку сегментоядерних нейтрофілів майже вдвічі. Також спостерігалось значне (р<0,05) зростання кількості еозинофілів у варіантах з досліджуваними пробами води, однак проби «Київ-Дніпро» та «Бортничі» спричиняли найбільше зростання даного показника.

Таблиця 1 – Лейкоцитарна формула (%) риб, Carassiusauratus, при впливі досліджуваних проб води

Форменні елементи крові

Контроль
n=15

Десна
n=15

Київ-Дніпро
n=15

Бортничі
n=15

Загальна кількість проаналізованих клітин

75000

75000

75000

75000

Паличкоядерні нейтрофіли

1,39±0,18

1,55±0,19

1,45±0,19

1,54±0,19

Сегментоядерні нейтрофіли

1,51±0,19

2,11±0,22*

2,66±0,22*

2,83±0,22*

Еозинофіли

0,26±0,08

0,58±0,12*

0,76±0,13*

0,83±0,14*

Базофіли

4,52±0,33

5,37±0,36

7,95±0,43*

7,75±0,42*

Моноцити

4,33±0,32

7,48±0,42*

7,29±0,41*

7,48±0,42*

Лімфоцити

84,91±0,57

79,80±0,64

73,69±0,70*

73,60±0,70*

Примітка: * – р<0,05 в порівнянні з контрольною групою

Показано, що при впливі досліджуваних проб, у порівнянні з контролем, вірогідно збільшувався рівень базофілів і моноцитів. Найбільшою мірою це проявлялося при тестуванні проб «Київ-Дніпро» й «Бортничі», де дані показники зросли майже вдвічі.

Отже, дослідження лейкоцитарної формули крові Carassiusauratus дозволяє виявити наявність домішок невизначеної природи в річковій воді. Наші результати дозволяють твердити про відносно меншу забрудненість проби з ріки Десни у порівняні з пробами, що були відібрані з ріки Дніпра. ці результати безпосередньо свідчать про можливість використання лейкоцитарної формули риб для визначення ступеню забруднення водних біотопів.

Результати мікроядерного аналізу представлені в таблиці 2. Одержані результати свідчать про наявність впливу антропогенного забруднення річкової води на частоту появи клітин крові з порушенням генетичного апарату. Всі досліджувані проби води достовірно (р<0,01) збільшували частку еритроцитів із мікроядрами та подвійними ядрами в крові піддослідних риб.

Після інкубації в пробах річкової води суттєво збільшувалась кількість епітеліальних клітин зябер з мікроядрами та подвійними ядрами (р<0,05). Серед даних порушень частіше зустрічались клітини з мікроядрами.

Таблиця 2 - Частоти ядерних порушень в різних тканинах срібного карасяCarassiusauratus, при впливі досліджуваних проб води

Показники

Досліджувані проби води

Контроль
n=15

Десна
n=15

Київ-Дніпро
n=15

Бортничі
n=15

Еритроцити
(3000 клітин)

МЯ

0,33±0,20

0,5±0,25

2±0,50*

2,75±0,58*

0,67±0,29

1,75±0,46*

3±0,61*

2,25±0,53*

Клітини зябер
(3000 клітин)

МЯ

0,92±0,34

1,25±0,39

2,5±0,55*

3,75±0,67*

1,83±0,47

0,75±0,30

1,25±0,39

2,5±0,55

Клітини хвостового плавця (3000 клітин)

МЯ

1±0,35

2,75±0,58*

5±0,77*

3±0,61*

1,33±0,40

1,75±0,46

1,5±0,43

2±0,50

Примітка: МЯ – клітини з мікроядрами, 2Я – клітини з двома ядрами, * – р<0,05 у порівнянні з контрольною групою

 

МЯобрез
Рис.1. Мікроядро в еритроциті риб, Carassiusauratus

Микроядро в жабрах
Рис.2. Мікроядро та подвійне ядро в клітинах зябер риб, Carassiusauratus
Микроядро в хвосте
Рис.3. Мікроядро в клітинах хвостового плавця риб, Carassiusauratus

Подібним чином реагували і епітеліальні клітини хвостового плавця, спостерігалось значне збільшення частки клітин з мікроядрами. В дещо меншій мірі, однак також достовірно зростала частка клітин з подвійними ядрами.

Слід зазначити, що найбільш вираженим був генотоксичний ефект зразків води, які отримували біля очисних споруд м. Києва (р-н Бортничі) та з Дніпра в районі Гідропарку.

Отже, дані мікроядерного тесту співпадають з результатами, що були визначені за допомогою лейкоцитарної формули. Мікроядерний тест виявився найбільш результативним на еритроцитах.

Антропогенне забруднення природних вод приводить до ослаблення антиоксидантної системи гідробіонтів, що супроводжується збільшенням частоти генетичних порушень в клітинах крові риб. Слід зазначити, що саме еритроцити крові є найбільш чутливою мішенню до дії активних форм кисню. Відомо, що іони важких металів можуть каталізувати утворення активних форм кисню [5], а з іншого боку – відігравати роль інгібіторів окремих ферментів антиоксидантної системи, що захищає клітини від наслідків окислювального стресу [6]. У цьому контексті визначення кількості клітин з мікроядрами та подвійними ядрами дає змогу оцінити інтегральний вплив досить широкого спектру забруднюючих факторів водного середовища на стан морських та прісноводних риб. З методичної точки зору, поєднання гематологічних і цитологічних методів для вивчення гідробіонтів дозволяє одержати інформацію про механізм токсичної дії чинників антропогенного забруднення водного середовища. Беручі до уваги зростаючу кількість забруднювачів у річкових акваторіях, прилеглих до регіонів з високим рівнем індустріалізації, ці показники життєдіяльності риб можуть бути використані для проведення постійного екологічного моніторингу природних вод, а також для оцінювання потенційного токсикологічного ризику присутніх у воді хімічних речовин для здоров'я людини.

Висновки
Таким чином, проведені дослідження з визначення впливу антропогенного забруднення річкових вод дозволили виявити зміни гематологічних та цитогенетичних показників риб, які можна запропонувати для біоіндикації [7, 8].
Результати з виявлення змін у генетичному апараті гідробіонтів під впливом забруднювачів прісної води, можуть бути екстрапольовані, певною мірою, на здоров'я людини, враховуючи той факт, що річкова вода є одним з основних джерел постачання питної води для населення України та інших країн Європи. Відносно прості та швидкі методи цитологічного аналізу тканин риб дозволяють проводити оцінку токсикологічного ризику присутності антропогенних забруднювачів прісної води.

Дуже вдалим виявляється те, що обидва теста – виявлення генетичних порушень і змін в лейкоцитарній формулі можуть бути проведені на тому ж самому препараті. Запропонований, нами метод можна також вважати відносно гуманним тому, що виготовлення препаратів периферійної крові не потребує забою піддослідних тварин. 
 

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

  1. Левич А. П. Теоретические и методические основы технологии регионального контроля природной среды по данным экологического мониторинга / А. П.Левич, Н. Г.Булгаков, В. Н.Максимов. – Москва: НИА-Природа, 2004. – 271 с.
  2. Козинец Г.И. Исследование системы крови в клинической практике / Г.И.Козинец, В.А.Макаров. – М.: Триада–Х, 1997. – 480 с.
  3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. – М.: Практика, 1999. – 459 с.
  4. Лакин Г. Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1980. – 293 c.
  5. Hornyak G.L. Effective medium theory characterization of Au/Ag nanoalloy–porous alumina composites / G.L. Hornyak, C.J. Patrissi, C.R. Martin, J.-C. Valmalette, L. Lemaire, J. Dutta, H. Hofmann  // Nanostruct. – 1997. – Vol.9. – P. 571-574.
  6. Rahatgaonkar A.M. A selective bioreduction of toxic heavy metal ions from aquatic environment by saccharomyces cerevisiae / A.M.Rahatgaonkar,  N.R.Mahore // E-Journal of Chemistry. – 2008. – Vol. 5, № 4. – P. 918-923.
  7. Патент України за заявкою № а 2008 01532, МПК (2006) G 01N 33/18. Спосіб визначення цитотоксичності водного середовища. / В.В. Гончарук, М.Р. Верголяс. – Заявл.06.02.2008. Рішення про видачу патенту від 24.11.2008.
  8. Гончарук В.В., Верголяс М.Р., Веялкина Н.Н. Оценка генотоксического влияния тяжелых металлов на клетки рыб // Збірник наукових праць Вінницького державного аграрного університету. Вінниця. – 2008. – Вип.34. Т.1. С. 171-176.

 

УДК 576.356.2/3:574.64(28)
Верголяс М.Р. Використання морфофункціональних змін клітин риб як біоіндикаторів хімічного забруднення водойм [Електронний ресурс]  / [Верголяс М.Р., Гончарук В.В.] // Збірник наукових статей “ІІІ-го Всеукраїнського з’їзду екологів з міжнародною участю”. – Вінниця, 2011. – Том.1. – С.298–301. Режим доступу: http://eco.com.ua/

Скачати в форматі pdf:

Оцінка: 
0
No votes yet