Спектрофотометрический метод определения параметров крови

В настоящее время хорошо разработан спектрофотометрический метод определения ряда характеристик гемолизированной крови. Он основан на измерении ослабления света и расчете концентрации поглощающего материала по найденной оптической плотности раствора в соответствии с законом Бугера – Бера.

Однако аналогичная задача для суспензии эритроцитов имеет ряд особенностей, связанных с рассеянием света. Для восстановления параметров среды по измерению рассеянного ею света нужно использовать достаточно громоздкие и неудобные при обработке вычислительные методики (в основном, инверсный метод Монте Карло [1]) Это затрудняет их широкое внедрение в практику. В данной работе, на основании аналитических подходов предложены достаточно простые спектрофотометрические способы измерения таких характеристик как степень агрегации эритроцитов, концентрация гемоглобина, степень оксигенации крови.

 

 

Определение степени агрегации эритроцитов. Эритроциты в норме представляют собой двояковогнутые диски. Их диаметр составляет 7 – 9 мкм, по краю толщина 1.7 – 2.4 мкм, а в центре 0.9 – 1.2 мкм [2, 3]. Эритроциты способны агрегировать, связываясь друг с другом основаниями дисков, и образовывать цилиндрические цепочки. Число эритроцитов в агрегате может быть от нескольких до сотен штук [2, 3]. Поэтому длина l цепочки может сильно варьироваться – от примерно 2 мкм до 200 и более мкм, тогда как ее диаметр меняется в существенно более узких пределах. Нарушение степени агрегации (длины l) эритроцитов может свидетельствовать о ряде патологий крови. Поэтому контроль степени агрегации эритроцитов важен для выявления ряда заболеваний крови и организма человека в целом.

Будем моделировать эритроциты цилиндром с круговым основанием диаметром d = 8 мкм и высотой l0 = 2 мкм. В [4] показано, что двояковогнутую структуру частиц можно просто учесть путем введения в показатель поглощения множителя, несколько изменяющего объем гемоглобина. Соответственно, агрегат эритроцитов будем полагать цилиндром, диаметр которого равен d, а длина – l = l0N, где N – число частиц в агрегате. Известно, что показатели поглощения раствора вещества и суспензии частиц из того же вещества могут сильно различаться. В первом случае показатель поглощения крови есть просто средневзвешенная сумма соответствующих показателей компонент (учитываем только основные компоненты – окси- HbO2 и деоксигемоглобин Hb)

,                                                   (1)

где a – коэффициент, характеризующий степень возможного разбавления пробы (a ≤ 1), который равен 1 для цельной крови, H – гематокрит (объемная доля эритроцитов в крови), f – объемная доля гемоглобина в эритроцитах, , kHb и ke – показатели поглощения соответственно окси-, деоксигемоглобина и эритроцитов, S – степень оксигенации крови, представляющая собой отношение концентраций оксигемоглобина и всего гемоглобина. Типичные значения H = 0.4, f = 0.25. В случае суспензии не весь свет попадает в эритроциты, содержащие гемоглобин. Часть его проходит вне частиц и не поглощается. В результате показатель поглощения суспензии при том же количестве гемоглобина будет меньше и равен

.                                               (2)

Здесь с £1 – поправочный коэффициент, говорящий о нарушении закона Бера для дисперсного поглотителя. Его значения как раз указывает долю массы, эффективно участвующей в поглощении. Значения с зависят от сечения поглощения эритроцитов. Сечение поглощения, в свою очередь, определяется известными показателями поглощения дериватов гемоглобина HbO2, Hb [5], размерами эритроцитов, в частности, искомой длиной l агрегатов, их ориентацией в пространстве. Аналитические выражения с и его расчет приведен в [6]. Показано, что поправочный коэффициент с ростом средней оптической толщины эритроцита убывает. Если измерить с, то можно определить l. Это делается следующим образом.

Исходная проба крови делится на две одинаковые части. Одна часть гемолизируется, т. е получаем раствор гемоглобина. Другая остается суспензией. Помещаем пробы в две кюветы одинаковой длины L и измеряем коэффициенты пропускания прямого света в обоих случаях. Эти коэффициенты (T*, T) описываются экспоненциальными зависимостями, и соответствующие им оптические плотности равны

,   .                                                      (3)

Здесь параметры со звездочками соответствуют раствору, без звездочки – суспензии; Lтолщина кюветы через которую проходит свет. Следует отметить, что второе выражение в (3) справедливо при условии, что можно в оптической плотности пренебречь влиянием показателя рассеяния суспензии. Эритроциты в плазме оптически “мягкие частицы”, имеющие сильно вытянутую вперед индикатрису рассеяния. Поэтому, если апертурный угол регистрирующего устройства порядка 10, то значительная доля рассеянного света попадет на приемник и можно пользоваться формулой для D.



Рис.1. Зависимость оптической плотности от l (а) и N(б); а: 1 – раствор, 2l = 2, 3 – 4, 4 – 40 мкм; б: 1 – l = 418, 2 – 400, 3 – 450нм

На рис. 1а по (3) построены спектральные оптические плотности при хаотическом распределении эритроцитов по углам и разной степени агрегации. Видно, что кривые сильно отличаются друг от друга, особенно в максимуме поглощения гемоглобина в полосе Соре (lmax @ 420 нм), где оптические размеры ked и kel0 отдельных эритроцитов или их агрегатов принимают наибольшие значения. Это связано с сильным изменением величины с и составляет физическую основу предлагаемого способа.Очевидно

.                                                                                   (4)

На рис. 1б представлены нормированные оптические плотности как функции N при разных длинах волн. Измерив D/D*, можно по приведенным градуировочным графикам определить степень агрегации. Как видно, чувствительность нормированной оптической плотности к N (или l) наибольшая вблизи максимума поглощения крови при l = 415 – 420 нм. Кривые 13 на рис. 1б слабо зависят от Nпри N> 20 или l > 40 мкм. Поэтому чувствительность уменьшается при указанных значениях N и l, так что способ практически применим при N< 20 или l < 40 мкм.

Определение концентрация гемоглобина в пробе крови. При решении этого вопроса основу аналитического подхода [7] составляет асимптотическая теория переноса излучения [8]. Область ее применимости как раз соответствует оптическим свойствам суспензии эритроцитов, особенно в красной и ближней ИК области спектра:

,                  (5)

где k – показатель поглощения среды, e = e'(1 – g) – приведенный показатель ослабления, e' – показатель ослабления, g – средний косинус индикатрисы рассеяния, τ и L – приведенная оптическая и геометрическая толщина среды. Входящие в (5) оптические характеристики явным образом связаны с искомыми параметрами крови. Если говорить о показателе поглощения, то эта связь приведена в (2).

При использовании этого подхода обычно измеряют коэффициенты диффузного отражения Rи пропускания T слоя среды. В эксперименте, естественно, необходимо учесть влияние границ рассеивающего слоя. Следует указать, что в асимптотической теории [8] это сделано, но для сравнительно малых коэффициентов отражения границ. Нами выполнен более точный расчет. Рассмотрена следующая система. Кювета с кровью накрыта стеклянной плоскопараллельной пластинкой. Снизу кювета имеет идентичную стеклянную подложку. Сверху по нормали к поверхности падает монохроматический направленный пучок света. Возникают многократные отражения света в трехслойной системе: верхняя граница (пластинка) – суспензия – нижняя граница (подложка). Их можно учесть и получить формулы для Rи T в такой системе, которые выражаются через достаточно точно рассчитываемые коэффициенты отражения и пропускания рассеивающей среды по асимптотической теории без учета границ и коэффициенты отражения границ r со стороны мутного слоя [9]. Последние оказываются при типичных условиях эксперимента равными 0.6 и 0.54

Для нахождения полной концентрации гемоглобина С можно предложить следующую методику.

Воспользовавшись формулами для T и R, рассчитаем номограмму, показанную на рис. 2а. Здесь при толщине кюветы 0.2 см, для указанных выше коэффициентов отражения от границ слоя изнутри 0.6 и 0.54 в системе координат TR построено два семейства кривых для λ = 800 нм, где показатели поглощения окси- и деоксигемоглобина равны 30 см-1 [5]. В одном семействе каждая кривая соответствует постоянному С и разным приведенным показателям рассеяния s=spH(1-g)/up(sp и up – поперечник рассеяния и объем эритроцита), а в другом – постоянному s и разным С. Номограмма позволяет по измеренным T и R определить С и s.

Если концентрация гемоглобина С измерена другим способом (в частности, спектрофотометрическим методом на гемолизированной крови), то можно определить приведенный показатель рассеяния и коэффициент отражения границы слоя. Для этого на рис. 2б в системе координат TR представлена другая номограмма. Она получена, для примера, при λ = 800 нм, С = 0.1, L = 0.2 см и разных s и r. Последние полагаем у верхней и нижней границ равными, что делает расчет несколько менее точным.

 

 
а)           

б)
Рис. 2. Номограммы RT при λ = 800 нм,  различных s и C (а), различных s и r (б)

 

После того, как найдены С и s, перейдем к определению S.

Для определения степени оксигенации крови необходимо измерять R или T на других длинах волн. На рис. 3 построены зависимости R и Т от S при C = 0.1. Видно, что с удалением от l = 800 нм чувствительность R и  к S растет. Это связано со спецификой спектров поглощения окси- и деоксигемоглобина. Увеличение толщины слоя также увеличивает чувствительность определения S по T.



Рис. 3. Зависимость коэффициентов диффузного отражения (а) и пропускания (б)
от степени оксигенации крови S при l = 700 (кривые 1), 750 (2) и 775 нм (3).
Для а - L = 0.2 см, для б -  сплошные линии L = 0.2 см, пунктирные 0.4 см

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Meinke M., Gersonde I., Friebel M., et al. // Appl. Spectrosc. – 2005. – V. 59. – P. 826 – 835.
2. Кассирский И. А., Алексеев Г. А.. Клиническая гематология, Москва: Медицина. 1970.
3. Левтов В. А., Регирер С. А., Шадрина Н. Х.. Реология крови, Москва: Медицина. 1982.
4. Науменко Е. К. // Журн. прикл. спектроск. – 2003. – Т. 70. – С. 375 – 380.
5. Prahl S. A.. http://omlc.ogi.edu/spectra/hhemoglobin/index.html.
6. Барун В. В., Иванов А. П. // Опт. спектроск. – 2004. – Т. 96. – С. 1019 – 1024.
7. Хайруллина А. Я. / Распространение света в дисперсной среде. Под ред. Иванова А. П. Минск: Наука и техника. 1982. С. 275 – 292.
8. Зеге Э. П., Иванов А. П., Кацев И. Л. Перенос изображения в рассеивающей среде. Минск: Наука и техника. 1985. 327 с.
9. Барун В. В., Иванов А. П. // Инж.-физ. журн. – 2011. – Т. 84. – С. 22 – 31.

УДК 535:34, 535:36
Иванов А. П. Спектрофотометрический метод определения параметров крови[Електронний ресурс]  / [Иванов А. П., Барун В. В., Петрук В. Г. и др.] // Збірник наукових статей “ІІІ-го Всеукраїнського з’їзду екологів з міжнародною участю”. – Вінниця, 2011. – Том.2. – С.371–373. Режим доступу: http://eco.com.ua/

Скачати в форматі pdf:

 

Скачати презентацію у форматі pdf

Оцінка: 
0
No votes yet